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ELISA試劑盒進(jìn)口大鼠如何解決產(chǎn)生組織切片非特異性染色
更新時(shí)間:2017-01-12   點(diǎn)擊次數(shù):1691次

ELISA試劑盒進(jìn)口大鼠如何解決產(chǎn)生組織切片非特異性染色

1、 抗體孵育時(shí)間過長、抗體濃度高易增加背景著色。這可通過縮短一抗/二抗孵育時(shí)間、稀釋抗體來控制。

2、 一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色,建議試用單克隆抗體看看。

3、內(nèi)源性過氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高(含血細(xì)胞多的組織),ELISA試劑盒進(jìn)口大鼠需要通過延長滅活時(shí)間和增加滅活劑濃度來降低背景染色;

4、 非特異性組分與抗體結(jié)合,這需要通過延長二抗來源的動(dòng)物免疫血清封閉時(shí)間和適當(dāng)增加濃度來加強(qiáng)封閉效果;

5、 DAB孵育時(shí)間過長或濃度過高;

6、 PBS沖洗不充分,殘留抗體結(jié)果增強(qiáng)著色,在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤為重要;

7、 標(biāo)本染色過程中經(jīng)常出現(xiàn)干片,這容易增強(qiáng)非特異性著色。

ELISA試劑盒進(jìn)口大鼠解決方案

1、首先排除抗體孵育條件。一般來說,著色效果的好壞與抗體的孵育條件是密不可分的,由于用SP法已經(jīng)做出來過一次且效果不錯(cuò),因此對(duì)于同樣組織的同一抗原進(jìn)行分析,這種因素可以先排除。

2、其次,DAB孵育時(shí)間是否太長?做出來那一次我是孵育8min,后來也是8-10min,我單獨(dú)做了一次實(shí)驗(yàn)來排除該因素。結(jié)果孵育2、5min時(shí)先出現(xiàn)背景,而特異性染色較淺,故這不符合常理,一般先出現(xiàn)特異性染色,然后隨著時(shí)間的延長,會(huì)出現(xiàn)非特異性背景著色。

3、zui后,血清封閉的問題?以前我一般孵育15-30min,所以我單獨(dú)做了一次實(shí)驗(yàn)用血清封閉室溫1h,其它條件同做出來的那一次,結(jié)果也一樣背景著色很深。

4、對(duì)PBS清洗不斷地延長時(shí)間和增加次數(shù),甚至*參照試劑盒說明書來進(jìn)行操作(我以前一般一抗4度且室溫復(fù)溫45min、二抗37度30min、Sp反應(yīng)37度30min),以及過氧化氫滅活加強(qiáng)等等均未起到效果。

5、步驟和組織切片*與*次做出來的一致(包括血清也是老試劑盒內(nèi)剩余的一點(diǎn)),奇跡出現(xiàn)了:結(jié)果很好。--因?yàn)榭乖贵w反應(yīng)除溫度、抗原/抗體濃度外,然后就是PH值,于是我測(cè)了新抗體稀釋液、老抗體稀釋液和PBS的PH值,ELISA試劑盒進(jìn)口大鼠結(jié)果是前者偏酸性(<6、0),而后兩者均在7、5左右。

 

 

 

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