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免疫細胞化學(xué)(ICC)的原理及操作
更新時間:2011-05-19   點擊次數(shù):2959次

【原理】
免疫細胞化學(xué)技術(shù)的原理是:把組織中的特異分子作為抗原,用各種在顯微鏡下可見的標記物標記特異抗體或標記抗原抗體復(fù)合物,使特異的免疫化學(xué)反應(yīng)具有可見性,從而間接地顯示抗原,達到在細胞或細胞器水平定位特異分子的目的。
【步驟】
SP法的基本步驟
1. 石蠟切片,常規(guī)脫蠟至水
2. 3%的過氧化氫去離子水孵育5-10min,消除內(nèi)原性過氧化物酶。蒸餾水沖洗。
3. 抗原修復(fù):微波熱修復(fù),取一定量的0.01M檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)于微波盒中,微波加熱至沸騰將脫蠟水化后的切片放入已沸騰的緩沖液中,中繼續(xù)處理10~15 min取出微波盒,冷卻至室溫取出玻片。先用蒸餾水洗2次,后用PBS洗5min。
0.01M檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0):檸檬酸三鈉 3g,檸檬酸 0.4g,加蒸餾水至1000ml。
4. 封閉:滴加正常山羊血清封閉液室溫10~20 min甩去多余液體,勿洗
5. 滴加適當稀釋的一抗,37℃ 2-3h或4℃過夜。
6. PBS沖洗,3分鐘×3次
7. 滴加生物素化二抗,37℃孵育10-15min。
8. PBS沖洗,3分鐘×3次
9. 滴加辣根酶標記鏈酶卵白素,室溫或37℃孵育10-15min
10. PBS沖洗,3分鐘×3次
11. AEC/DAB顯色
12. 蒸餾水反復(fù)洗滌后,甘油明膠封片。甘油明膠:明膠 40g、甘油 250ml、蒸餾水 210ml、石炭酸 5ml,混勻,過濾。
13. 顯微圖象分析:取處理組和對照組各2張免疫組織化學(xué)的玻片,每張玻片隨機取5個視野,OLYMPUS IX70倒置顯微鏡下觀察,KODAK數(shù)碼相機拍照記錄。捷達形態(tài)學(xué)圖象分析系統(tǒng)分析記錄圖片的總IOD值。
 

 

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